神经

一种用于生成研究及治疗用途的多巴胺能神经元的新方法

作者:佚名 来源:优宁维生物 日期:2022-10-07
导读

          人类多能干细胞(hPSCs)是一种能够分化成为任何一种具有自我更新能力的细胞类型,在研究和治疗方面都有巨大的潜力。 当打算将这些细胞在治疗环境中使用这些细胞时,需要一种能量化的具有一致性的良好生产规范(GMP)标准。 由Jisun Kim博士和哈佛医学院的团队领导的一项新研究发表在《Nature protocols》杂志上,提出了一种新的方案,可以在一个“点(spot)”中(一个小的、封闭的区域)而不是传统的二维单层膜中培养和分化hPSCs1。该持续28天的实验方法可以产生丰

关键字:  多巴胺能神经元 

        人类多能干细胞(hPSCs)是一种能够分化成为任何一种具有自我更新能力的细胞类型,在研究和治疗方面都有巨大的潜力。 当打算将这些细胞在治疗环境中使用这些细胞时,需要一种能量化的具有一致性的良好生产规范(GMP)标准。

        由Jisun Kim博士和哈佛医学院的团队领导的一项新研究发表在《Nature protocols》杂志上,提出了一种新的方案,可以在一个“点(spot)”中(一个小的、封闭的区域)而不是传统的二维单层膜中培养和分化hPSCs1。该持续28天的实验方法可以产生丰富的中脑多巴胺祖细胞(mDAPs)和中脑多巴胺神经元(mDANs),是研究和治疗的理想选择。

        该方案已经在帕金森氏症(PD)的研究中取得了成功,该疾病的病理特征之一是黑质致密部中脑多巴胺能(mDA)细胞的丢失,这使得细胞替代疗法具有诱人的前景。

        最近,研究人员在帕金森病的临床前小鼠模型中使用了这种“spotting”的方法,移植了mDAPs的研究样本恢复了运动功能2。更令人兴奋的是,该方案首次应用于不需要免疫抑制剂的散发性PD患者的自体细胞替代治疗;祖细胞植入18-24个月后,患者PD症状稳定或改善3。

        将hPSCs分化成mDA

        在一个6cm的培养皿上,将1 × 104的 hPSCs在6个10 μl的spot上培养。 在28天内,细胞经历了三个阶段分别是:floor plate(FP)、neural progenitor(NP)和mDAP/mDAN阶段。

        FP和NP阶段后,细胞在第15天进行单层培养,以避免细胞过度堆积,并允许继续分化。 FP和NP阶段包括添加信号化学物质的组合,如LDN、FGF8和CHIR,而BDNF和GDNF等神经营养因子则在最后的mDAP/mDAN阶段添加。

        与传统方法相比,spotting的方法明显减少了培养基的酸化。且能够更有效地生成mDA细胞,即时是在不良的培养条件下,此方法导致的细胞脱落相关的细胞损失要少得多(图3)。值得注意的是,由于严重的细胞损失,几乎90%的传统2D单层法的尝试在第28天都无法提供有意义的数据,而spotting法大多成功,且其产生的mDA细胞比传统的二维单层培养法更健康。

        在第12和14天使用FACS测量总细胞损失/输入细胞数,如参考文献10所述,在第15天细胞复制前测量总细胞产量/输入细胞数。 b、细胞损失率与细胞产量之比表明,斑点培养法的细胞损失率与细胞产量之比明显低于单层培养法。 c,死亡细胞百分比在第15天最后收获时测定。 d - f, tunel阳性细胞(d), cleaved caspase-3阳性细胞(e)和细胞死亡相关基因的RNA表达(f)被测量来代表细胞在第15天的状态,如参考文献10所述。 *P < 0.05

        最终在第0天和第28天通过关键mDA标记的免疫细胞化学,以及通过TH+、ALDH1A1+和GIRK2+的免疫荧光共同染色来表征细胞表型(APC-006, Alomone Labs )。

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